בספרייה הלאומית אוסף כתבי יד מקיף בתחומים רבים, בהם תחומי הליבה של הספרייה: כתבי יד עבריים, כתבי יד אסלאמיים וכן כתבי יד לועזיים.
המכון לתצלומי כתבי יד עבריים בספרייה הלאומית אוסף עותקים של כל כתבי היד העבריים, המצויים באוספים ציבוריים ופרטיים ברחבי הארץ והעולם. כמו כן, באוסף כתבי היד יש מגוון של כתבי יד לועזיים, בעיקר מאירופה, אך גם מיבשות אחרות, החל מהמאה התשיעית.
פרויקט "מכתוב" לכתבי יד אסלאמיים מאפשר גישה לכ-2,500 כתבי יד אסלאמיים נדירים.
לאור ההתפתחויות הטכנולוגיות המהירות שמאפשרות שימור, הצגה ונגישות לתוכן דיגיטלי, פתחה הספרייה הלאומית בתהליך של חידוש האוסף של צילומי כתבי היד העבריים. מיזם "כתיב", המשותף לספרייה הלאומית ולאגודת FJMS של אלברט ד' וננסי פרידברג, נועד להפוך את כתבי היד העבריים לנגישים לכל אדם מכל מקום בעולם. תמונות כתבי היד, יישמרו ויוצגו בטכנולוגיה המתקדמת ביותר ובאיכות הגבוהה ביותר וישמשו קהילות של חוקרים וקוראים.
הספרייה הלאומית מחזיקה באוסף מגוון של כתבי יד לועזיים, בעיקר מאירופה, אך גם מיבשות אחרות, החל מהמאה התשיעית. מרבית כתבי היד הגיעו לאוספי הספרייה דרך תרומות. האוסף הפרטי של אברהם שלום יהודה הוסיף לספרייה פריטים נדירים ומרהיבים, כגון ספרי שעות (ספרי תפילה נוצריים) מהודרים מהמאה ה-16, כתבי יד ה"וולגטה" (התנ"ך והברית החדשה בתרגום ללטינית) והאוסף הגדול של כתבי היד התיאולוגיים של אייזק ניוטון. חלק ניכר של האוסף עבר דיגיטציה ועומד לרשות כלל המתעניינים באתר ובקטלוג הספרייה הלאומית.
פרויקט "מכתוב" הוקם במטרה לאפשר גישה לכ-2,500 כתבי יד וספרים אסלאמיים נדירים. מטרת הפרויקט היא להנגיש סריקות של כתבי יד באיכות גבוהה לקהל הרחב, אשר תאפשר לחקור ולגלות את אוצרות אוסף כתבי היד האסלאמיים בספרייה.
